Het actieve centrum in een haloperoxidase enzym.

Hart van vanadium haloperoxidase enzymen blootgelegd

22 mei 2015

Chemici van de onderzoeksgroep Biokatalyse van het Van 't Hoff Institute for Molecular Sciences hebben zeer gedetailleerd inzicht verkregen in het actieve centrum van vanadium haloperoxidase enzymen. Hun onderzoek verklaart de opmerkelijke werking van een chloroperoxidase-enzym dat ze ruim twintig jaar geleden ontdekten, alsmede van een door hen ontwikkelde mutant. Deze enzymen hebben onder andere potentie voor toepassing in bacterie- en virusdodende middelen.

In een recente publicatie in het Journal of the American Chemical Society (JACS) beschrijven de HIMS chemici niet eerder waargenomen details met betrekking tot de rol van waterstofionen in het actieve centrum van de enzymen. In nauwe samenwerking met experts in vaste-stof-NMR van de University of Delaware (VS) stelden ze de zogenaamde protoneringstoestand van het vanadaat vast.

Hypohalietzuren

Met vanadium-haloperoxidases wordt een klasse van enzymen aangeduid die in de natuur veelvuldig voorkomt. Zo spelen ze in allerlei zeewieren een rol in de verdediging tegen binnendringende organismen. In ziekmakende plantenschimmels hebben ze een rol bij de afbraak van de celwand van de plant.

ascophyllum-nodosum-grisetang

Knotswier (Ascophyllum nodosum).

De werking van de enzymen berust op de productie van hypohaliet zuren, via de omzetting van haliden (met name chloride en bromide) met behulp van waterstofperoxide. In de plantenschimmels zijn chloroperoxidases te vinden die chloride (Cl^-) omzetten tot hypochloriet (HOCl), dat ook de actieve stof is in bleekwater. Zeewieren beschikken over bromoperoxidases die uit bromide (Br^-) hypobromiet (HOBr) maken, dat vergelijkbare eigenschappen heeft, maar minder stabiel te bewaren is.

De synthese van de hypohaliet zuren maakt de enzymen interessant voor allerlei toepassingen, van wasmiddelen tot bacterie- en virusdodende middelen. De Biokatalyse groep van HIMS onderzocht bijna dertig jaar de werking van vanadium bromo- en chloroperoxidasen onder leiding van professor Ron Wever, die vorig jaar met emeritaat ging.

Octrooien

Aan het begin van de jaren negentig van de vorige eeuw ontdekte de groep een vanadium chloroperoxidase met voldoende stabiliteit voor daadwerkelijke toepassing. Dat leidde tot vele publicaties en twee octrooien. Een octrooi beschrijft het gebruik als blekende en ontsmettende component in huishoudelijke producten zoals bijvoorbeeld waspoeder. Het ander betreft toepassing in verven ter verhindering van de aangroei van algen en andere organismen aan scheepsbodems en maritieme constructies, zoals boorplatforms.

Aangroei scheepshuid

Aangroei op scheepshuid.

Voor de laatste toepassing was het noodzakelijk het enzym te optimaliseren voor werking bij pH 8, de zuurgraad van zeewater. Door de groep is daarom met behulp van zogenaamde directed evolution een enzymmutant ontwikkeld die bij deze pH honderd maal actiever is dan het oorspronkelijke enzym. Dit is onder andere gedaan door voormalig groepsmedewerker Rokus Renirie, die inmiddels bij IVAM UvA BV werkt, een onderzoeks- en adviesbureau op het terrein van duurzaamheid. Hij heeft er onder andere de bacterie- en virus dodende toepassingen van de effectieve enzymmutant in zijn portfolio.

Tweestaps mechanisme

Parallel aan het ontwikkelen van toepassingen is ook veel wetenschappelijk onderzoek verricht naar de factoren die de katalytische snelheden van het oorspronkelijke ('wildtype') enzym en de mutant bepalen. Zo zijn veel details beschikbaar over de structuur van het enzym en het mechanisme, verkregen met een breed scale aan spectroscopische technieken zoals X-ray, UV-VIS, EPR, V-EXAFS en V-NMR in combinatie met steady-state en pre-steady state kinetiek en mutagenese.

Het beeld is dat vanadium zich in het actieve centrum van het enzym bevindt in de vorm van vanadaat (HVO[4]^2-). In een tweestapsmechanisme wordt aan dit centrum eerst waterstofperoxide gebonden, waarna een halide ion met dit "peroxo-intermedair" reageert en het hypohaliet zuur HOX wordt gevormd.

Protoneringstoestand

De recente JACS publicatie, met Wever en Renirie als co-auteurs, geeft nu nog meer helderheid over het katalytisch mechanisme. Dankzij intensieve samenwerking met met de vaste-stof NMR groep van professor Tatjana Polenova van de Universiteit van Delaware (VS) lukte het de protoneringstoestand van het vanadaat in het katalytisch centrum te bepalen. De protoneringstoestand geeft aan welke rol waterstofionen (H^+) spelen.

At the heart of vanadium haloperoxidases

Illustratie uit het artikel in JACS. Vaste-stof NMR toont aan dat de protoneringstoestand (en daarmee de reactiviteit) pH afhankelijk is, weergegeven aan de rechterkant.

Via de zogenaamde Magic Angle Spinning (MAS) techniek is met NMR in de vaste-stof fase veel meer detail waarneembaar dan in oplossing. Door de verkregen data te combineren met kwantummechanische berekeningen volgens de dichtheidsfunctionaaltheorie (DFT), waren vervolgens de protoneringstoestanden van de vanadaat cofactor te beredeneren. Deze blijkt inderdaad pH-afhankelijk en is inderdaad verschillend voor het oorspronkelijke enzym en de mutant. Het onderzoek geeft dus duidelijk aan dat de protonering de positie bepaalt van het pH-optimum van de enzymactiviteit.

Daarnaast heeft de hoge gevoeligheid van de vaste-stof NMR in de huidige studie tot een verbetering van de wildtype data geleid vergeleken met een eerdere publicatie in 2006. Tenslotte wordt in de huidige JACS publicatie aannemelijk gemaakt dat een watermolecuul axiaal aan de vanadaat cofactor bindt. Dit watermolecuul dissocieert bij reactie met waterstofperoxide, waarbij het peroxide gebonden wordt.

Publicatie

Rupal Gupta, Guangjin Hou, Rokus Renirie, Ron Wever, Tatyana Polenova: ^51V NMR Crystallography of Vanadium Chloroperoxidase and Its Directed Evolution P395D/L241V/T343A Mutant: Protonation Environments of the Active Site. J. Am. Chem. Soc., 2015, 137 (16), pp 5618-5628. DOI: 10.1021/jacs.5b02635

* Lees het artikel online

Zie het origineel.

* Website onderzoeksgroep Biokatalyse

Gepubliceerd door HIMS