Universiteit Leiden

Negentig procent van alle geneesmiddelen wordt afgebroken door één type enzym: de cytochromen P450. Maar het is nog een raadsel hoe geneesmiddelen in dat enzym terechtkomen. De holte waarin reacties plaatsvinden zit diep in het enzym, maar niemand heeft nog een opening kunnen vinden waardoor stoffen erin of eruit kunnen. Peter Keizers gaat met een Veni-subsidie uitzoeken hoe de plaats van actie wordt bereikt.

Afbeelding
Peter Keizers: 'Het zou natuurlijk het allerleukste zijn als je de hele omzetting kunt volgen, bijvoorbeeld in een reageerbuis.' Warme belangstelling
P450's zijn veelzijdige enzymen: ze breken niet alleen medicijnen en andere vreemde stoffen af, maar helpen ook geslachtshormonen en galzuren vormen. Ze hebben de warme belangstelling van de farmaceutische industrie. Wie een medicijn op de markt brengt wil immers dat het een bepaalde tijd in het menselijk lichaam aanwezig is. P450 breekt de meeste medicijnen af, zodat je ze via de urine kwijt kunt raken. Als je dat proces kunt beïnvloeden kun je misschien ook de werkzaamheid van een medicijn beïnvloeden. Geen ingang
De kristalstructuur van P450s is bekend, maar daarin is geen ingang te zien waardoor stoffen naar binnen kunnen. Hoe bereikt een geneesmiddel of andere stof dan de plaats van actie: de holte in het enzym waar de reactie plaatsvindt?

Afbeelding: In de kristalstructuur van P450 is geen gat te zien waardoor een geneesmiddel naar binnen kan. Spectroscopie
Tot nog toe zijn P450's vooral bestudeerd door te bepalen welke stoffen erin worden omgezet, en waarin die stoffen worden omgezet. Bijvoorbeeld door aan een reageerbuisje met rattenlevercellen een medicijn toe te voegen en met massaspectroscopie te kijken wat voor moleculen dan geproduceerd worden. Maar die studies zeggen niet veel over hoe die omzetting gebeurt. Ook is een gedeelte van het enzym, de ijzerhoudende haemgroep plus directe omgeving, bestudeerd met spectroscopie, juist omdat die haemgroep gemakkelijk te zien is door het ijzeratoom. De haemgroep is ook een interessant deel, omdat daar de omzettingen plaats moeten vinden - maar het enzym is veel groter dan de haemgroep, en men vermoedt dat de rest van het enzym ook een belangrijke rol kan spelen bij interacties tussen geneesmiddelen of het bepalen welke stoffen wel of niet worden omgezet. Maar die delen zijn juist niet bestudeerd omdat ze zo moeilijk te meten zijn. Rondtollen
Veni-winnaar Keizers kiest voor een andere aanpak: hij gaat naar het begin van de enzymreactie kijken met behulp van paramagnetische NMR. Paramagnetische NMR werkt net als gewone NMR, je meet het rondtollen van atoomkernen in een magneetveld, maar je zet een paramagnetisch atoom in de buurt van het molecuul of eiwit dat je wilt meten. Een paramagnetisch atoom produceert een relatief sterk eigen magneetveldje als het in een groter magneetveld (zoals dat van het NMR-apparaat) wordt gestopt, waardoor de atomen in de buurt andere signalen afgeven. Door de signalen vóór de toevoeging van het paramagnetisch atoom te vergelijken met de signalen daarna, kun je zien waar de atomen zich bevinden ten opzichte van het paramagnetisch atoom. Afbeelding: Als de kooi met het metaalion wordt vastgezet aan het enzym, beïnvloedt het magneetveld een deel van het eiwit. Signalen
Keizers: 'Dat wil zeggen dat wanneer we een speciaal atoom of ion op het enzym plakken, dat de signalen van alle atomen in de buurt daarvan verschuiven. Die signalen vangen we op. We willen dit vooral doen met lanthaniden, dat zijn zeldzame metalen zoals europium en gadolinium, want dat zijn sterke paramagneten. Hoe dichter de atomen zich bij de lanthanide bevinden, des te groter de verschuiving van hun signaal. Zo kun je een nauwkeuriger beeld krijgen van de structuur van het eiwit, en bovendien kun je volgen wat er gebeurt als er een molecuul in het P450 enzym wordt opgenomen.' Kooien
Keizers heeft al complexen gemaakt, kooien genoemd, waarin hij die metalen vastzet. 'De volgende stap is dat we het enzym muteren op de plaatsen die we willen bestuderen, zodat er speciale reactieve aminozuren op die plek op het oppervlak komen, waaraan de kooi gekoppeld kan worden. Omdat een lanthanide niet het hele eiwit goed kan 'scannen' zullen we verschillende experimenten doen waarbij we het complex op verschillende plaatsen op het eiwitoppervlak aanbrengen, zodat we een totaalbeeld krijgen.' Pad
Een tweede methode die Keizers wil gaan toepassen is het volgen van het medicijn zelf, door het eveneens paramagnetisch te maken. 'Dat kan helaas niet met diezelfde lanthaniden, omdat het metaalion met kooi waarschijnlijk zo groot is dat het medicijn niet meer in de holte kan komen. Maar wel is het mogelijk een zogenoemd stabiel radicaal aan het medicijn vast te maken. De signalen van de atomen van het eiwit waar die groep langskomt op weg naar de holte worden zwakker. Zo wordt duidelijk welk pad het medicijn heeft genomen.' Mal
Keizers hoopt met zijn experimenten een paar kwesties op te lossen. Allereerst zijn er veel interacties tussen geneesmiddelen onderling, op die P450's. Een aantal daarvan zou veroorzaakt kunnen worden doordat er naast het geneesmiddel in de holte waar de omzetting plaatsvindt, een tweede geneesmiddel bindt dat de omzetting van het eerste kan beïnvloeden. Maar waar bindt dat dan? Op wat voor plaatsen kan dat? Ook worden enzymen vaak beschouwd als een soort mal waar precies één molecuul in past, als een sleutel in een slot; maar de katalytische holte van P450's is erg groot, misschien omdat ze zoveel verschillende stoffen moeten omzetten. Maar toch worden sommige stoffen wel, en andere niet omgezet. Zou het kunnen dat het onbekende ingangskanaal, dat het enzym kennelijk kan openen om stoffen binnen te laten, selecteert welke stoffen wel of niet in het katalytische holte kunnen komen om te worden omgezet? Hele omzetting
Er is dus voorlopig nog genoeg te doen om te achter te komen wat er nou eigenlijk gebeurt als een medicijn of andere stof een P450 ontmoet. Maar als het pad eenmaal is uitgestippeld, wat wil Keizers dan doen? 'Wat ik nu doe is naar het begin van de enzymreactie kijken hoe het medicijn in de holte komt. Vervolgens vindt er een omzetting plaats, en het zou natuurlijk het allerleukste zijn als je de hele omzetting kunt volgen, bijvoorbeeld in een reageerbuis.'

(14 oktober 2008/Eric-Wubbo Lameijer)