LUMC



Promotie Geneeskunde

Woensdag 12 juni 2008
15.00 uur mw. S.A.J. ter Horst
Samenvatting:
Nederlands/ Engels Titel: Oxidative stress in experimental bronchopulmonary dysplasia
Promotor(en) Prof. Dr. F.J. Walther

Samenvatting:

Het doel van het onderzoek beschreven in dit proefschrift is tweeledig. Ten eerste het karakteriseren van een diermodel voor experimentele bronchopulmonale dysplasie (BPD), dat geschikt is voor interventiestudies. Ten tweede het ontwikkelen van nieuwe en effectievere therapeutische mogelijkheden met minder bijwerkingen in het rattenmodel van door hyperoxie geïnduceerde neonatale chronische longschade, om de morbiditeit en mortaliteit te verminderen in zeer premature kinderen die behandeld worden voor het "respiratory distress syndrome" (RDS) en daarom een verhoogd risico hebben op het ontwikkelen van BPD.

Hoofdstuk 1 beschrijft de klinische presentatie, historie, pathofysiologie en huidige therapeutische mogelijkheden voor BPD, een chronische longaandoening in zeer premature kinderen die behandeld worden voor respiratoire insufficiëntie ten gevolge van RDS. Typische pathologische kenmerken van BPD zijn een verstoorde alveolarisatie en vascularisatie van de onrijpe long. De belangrijke rol van surfactant, ontsteking en stolling in de pathofysiologie van BPD wordt besproken en daarnaast wordt ingegaan op eventuele aanknopingspunten voor nieuwe therapieën. Twee aan elkaar gerelateerde processen die een belangrijke rol spelen in de pathofysiologie van BPD, zijn ontsteking en een verstoorde balans van de stollings- en fibrinolytische cascade, die uiteindelijk leiden tot extravasculaire fibrinedepositie in de long. De focus van dit proefschrift is gericht op de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor BPD door de vicieuze cirkel van ontsteking en stolling te doorbreken. Theoretisch kan dit bereikt worden door de verstoorde balans van de stollings- en fibrinolytische cascade te verbeteren, waardoor fibrinedepositie in de long verminderd wordt of door de ontstekingsrespons te remmen.

Hoofdstuk 2 beschrijft de karakterisatie van het rattenmodel voor experimentele BPD. In dit model worden prematuur geboren rattenpups continu blootgesteld aan 100% zuurstof tijdens het sacculaire stadium van longontwikkeling, dat overeenkomt met het longstadium van zeer premature kinderen met een verhoogd risico op het ontwikkelen van BPD. Differentiële gen-expressieprofielen zijn bestudeerd met DNA microarray analyse en bevestigd door middel van RT-PCR en kwamen overeen met histopathologische en fibrinedepositie gegevens. Uit deze analyse bleek dat genen die betrokken zijn bij ontsteking, stolling, fibrinolyse, extracellulaire matrix turnover, celcyclusregulatie, signaaltransductie en alveolaire vergroting differentiëel tot expressie werden gebracht. Blootstelling aan hyperoxie resulteerde in een heterogene alveolaire ontwikkeling door een afname van de secundaire septatie, een toename in alveolaire septumdikte, een grote influx van leukocyten, fibrinedepositie en fibrose. Een forse toename van de fibrinedepositie in de long na blootstelling aan hyperoxie werd bevestigd door middel van kwantitatieve Western blotting. Deze resultaten laten zien dat de aan hyperoxie blootgestelde premature rattenpup een uitstekend model is om de pathofysiologie van BPD in premature neonaten beter te onderzoeken. Daarom is dit experimentele BPD model in de vervolgonderzoeken in dit proefschrift gebruikt om nieuwe therapieën te ontwikkelen.

Ondanks dat surfactantdeficiëntie een belangrijke rol speelt in de pathogenese van BPD, zijn de spatiële en temporele expressiepatronen van de surfactanteiwitten nog niet volledig bekend in premature kinderen en proefdieren met (experimentele) BPD. In hoofdstuk 3 wordt de spatiële en temporele expressie beschreven van de vier surfactanteiwitten (SP-A, SP-B, SP-C en SP-D) en Clara cell secretory protein (CC-10) in de longen van premature rattenpups blootgesteld aan kamerlucht en hyperoxie. mRNA expressie van de surfactanteiwitten en CC-10 is bestudeerd met RT-PCR en in situ hybridisatie en eiwitexpressie van SP-A, SP-D en CC-10 met immunohistologische technieken. De expressie van de vier surfactant-eiwitten was hoog bij de geboorte en nam vervolgens af tijdens de normale neonatale longontwikkeling. Blootstelling aan hyperoxie leidde tot een sterke stijging van SP-A, SP-B en SP-D mRNA in de neonatale periode. CC-10 mRNA expressie was niet veranderd tijdens de neonatale periode of na blootstelling aan 100% zuurstof. De cellulaire distributie van SP-B, SP-C, SP-D en CC-10 in de long was gelijk in kamerlucht en hyperoxie in paraffine coupes. Op mRNA- en eiwitniveau was de SP-A expressie hoog in de alveolaire type 2 cellen en laag in de bronchiale Claracellen tijdens de normale neonatale ontwikkeling. Na blootstelling aan hyperoxie steeg de SP-A expressie in bronchiale Claracellen. De toegenomen SP-A expressie tijdens hyperoxie kan deels verklaard worden door een toename in mRNA en eiwit expressie van SP-A door bronchiale Claracellen. De extra rol van Claracellen in de verdediging tegen longschade geïnduceerd door hyperoxie, suggereert dat Claracellen de functie van alveolaire type II cellen kunnen ondersteunen en een belangrijke rol kunnen spelen in de surfactantvoorziening in de alveoli.

In hoofdstuk 4 worden de effecten beschreven van de niet-specifieke fosfodieësterase remmer pentoxifylline, een methylxanthine derivaat, op de ontwikkeling van hyperoxie-geïnduceerde longschade in premature rattenpups en hun overleving. Pentoxifylline verlengde de gemiddelde overleving van rattenpups blootgesteld aan 100% zuurstof, met gemiddeld 3 dagen en resulteerde in een 66% vermindering van de pulmonale fibrinedepositie, gekwantificeerd met behulp van de Western blot-techniek. Bij de analyse van sleutelgenen betrokken bij de pathogenese van experimentele BPD op mRNA niveau werden slechts marginale verschillen waargenomen na behandeling met pentoxifylline. De totale eiwitconcentratie in bronchoalveolair lavagevocht was verminderd met 33% in de met pentoxifylline behandelde rattenpups. Pentoxifyllinebehandeling leidde tot een vermindering van de alveolaire fibrinedepositie en een verlenging van de overleving in premature rattenpups met experimentele BPD en kan mogelijk verklaard worden door vermindering van capillaire alveolaire lekkage.

In hoofdstuk 5 wordt de rol van inhalatie "nitric oxide" (iNO) als therapie in experimentele BPD onderzocht. Premature rattenpups werden blootgesteld aan kamerlucht, hyperoxie of een combinatie van hyperoxie en een klinisch relevante dosis NO (8,5 en 17 ppm). De anti-inflammatoire effecten van iNO therapie werden bestudeerd aan de hand van overleving, histopathologie, fibrinedepositie en differentiële mRNA expressie (real-time RT-PCR) van sleutelgenen in de ontwikkeling van BPD. iNO therapie verlengde de mediane overleving met 1,5 dagen, verminderde fibrinedepositie dosisafhankelijk met maximaal een faktor 4,3, verbeterde de alveolaire ontwikkeling door middel van een vermindering van de dikte van de alveolaire septa en een verminderde influx van leukocyten. Analyse van de mRNA expressie data resulteerde in een differentiële expressie van genen betrokken bij ontsteking, stolling, fibrinolyse, celcyclusregulatie en alveolaire vergroting. iNO therapie verbeterde longpathologie en verlengde de overleving door een vermindering van de dikte van de alveolaire septa, remming van de ontstekingsrespons en vermindering van de fibrinedepositie in premature rattenpups met experimentele BPD.

Hoofdstuk 6 behandelt de interessante resultaten en de beperkingen van het gepresenteerde onderzoek. Tevens worden de toekomstmogelijkheden geëxploreerd voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische mogelijkheden voor premature neonaten met BPD. Het gebruik van een diermodel voor BPD vergroot de mogelijkheden voor uitgebreid onderzoek, maar zal nooit de humane klinische setting volledig kunnen evenaren. Zowel het gebruik van fosfodiesteraseremmers en iNO zijn veelbelovende nieuwe therapeutische mogelijkheden en zouden misschien in de toekomst een rol kunnen spelen in de behandeling van premature neonaten met RDS en een verhoogde kans op de ontwikkeling van BPD. Het onderzoek beschreven in dit proefschrift suggereert dat interruptie van de vicieuze cirkel van ontsteking en stolling in BPD de morbiditeit en mortaliteit van premature neonaten met BPD kan verbeteren.