Omzetting nitriet in broeikasgas te volgen als flikkerlicht
De onderzoekers hebben met genetische technieken een kleine
modificatie aan de buitenkant van het enzym aangebracht die niets
verandert aan de structuur en de activiteit van het NiR, maar waarmee
wel een soort van haakje is gecreëerd waaraan ze het label kunnen
vastzetten via een chemische reactie.
Het nitirietreductase is vastgezet op een glasplaatje met behulp van
een moleculair 'touwtje', en wordt in een microscoop beschenen met een
sterk gefocusseerde laser bundel. Er is maar één NiR molecuul in het
brandpunt van de laser. De fluorescentie van het label wordt door het
objectief van de microscoop afgebeeld op een supergevoelige
lichtdetector.
Het enzym nitrietreductase (NiR) zorgt ervoor dat nitriet wordt
omgezet in het broeikasgas stikstofmonoxide.
De precieze werking van het enzym was nog niet bekend, omdat het te
klein is om met bestaande microscopische technieken te bekijken.
Leidse en Nijmeegse onderzoekers hebben nu met een nieuwe techniek,
die enzymdeeltjes een fluorescerend label geeft, ontdekt dat NiR
wisselt van kleur, al naar gelang de fase in het reactieproces: sterke
fluorescentie betekent dat het enzym bezig is, zwakke fluorescentie
betekent: het enzym doet even niets.
Ook hebben ze op elektronniveau gedetailleerde kennis over het
reactieproces gekregen.
De vinding staat beschreven in de online Early Edition van het
wetenschappelijke topblad
PNAS (26-2-08).
Kunstmest
De omzetting van nitriet in stikstofmonoxide gebeurt bijvoorbeeld in
kunstmest die over het land is uitgestrooid. Het is het werk van
bacteriën die gebruik maken van het enzym NiR. Daarbij is eerst
nitraat omgezet in nitriet, met behulp van weer een ander enzym.
Multi-inzetbare techniek
Prof. dr. Gerard Canters, Universiteit Leiden: De vinding is om
meerdere redenen interessant. In de eerste plaats hebben we nu een
extra techniek tot onze beschikking gekregen om individuele enzymen te
bestuderen als ze aan het werk zijn. Tot voor kort was dit maar
beperkt mogelijk. Ten tweede is de techniek niet alleen geschikt om
nitrietreductase te onderzoeken. Alle enzymen die van kleur wisselen
als ze aan het werk zijn, lenen zich in principe voor deze techniek.
Biosensoren
Een derde winstpunt is dat de techniek de mogelijkheden verruimt voor
het gebruik van enzymen in biosensoren. Canters: Biosensoren kunnen
van groot belang worden voor de detectie van giftige stoffen, voor het
meten en bewaken van het milieu en industriële afvalstromen, en onze
gezondheid. Denk aan de glucosesensor voor diabeten, en sensoren voor
cholesterol of ureum.
Katalysator
Enzymen (te herkennen aan de uitgang ase) zijn eiwitten die fungeren
als katalysator: ze versnellen reacties zonder zelf te veranderen.
Enzymen en andere eiwitten zorgen ervoor dat ons lichaam blijft
functioneren. Maar enzymen kunnen ook op vele andere manieren nuttig
worden gemaakt, bijvoorbeeld in wasmiddelen. Het is dus van groot
belang om te weten hoe ze precies werken.
Biergebruik
Het één voor één onderzoeken van individuele enzymdeeltjes is
belangrijk om de vraag te beantwoorden welke individuele variatie
schuil gaat achter een gemiddelde over een zeer groot aantal deeltjes.
Vergelijk het met een enquête over het dagelijkse biergebruik van de
Nederlander, zegt Canters. Die consumptie zal verschillen naar gelang
de omstandigheden. Zo is het ook bij de omzetting van nitraat in
nitriet. Er zijn nu verschillende hypotheses over de manier waarop die
reactie verloopt, met name over het elektronentransport in het enzym.
Waarschijnlijk kan het reactieproces langs verschillende wegen gaan,
afhankelijk van de omgeving waarin de reactie zich voltrekt. Maar om
de mogelijkheden statistisch in kaart te brengen en om verschillen te
kunnen verklaren moet je de werking van heel veel individuele enzymen
bekijken. Met onze techniek kan dat.
Hoe wordt nitriet omgezet in stikstofoxide? De details
Nitriet (NO2¯) wordt omgezet in stikstofmonoxide (NO) doordat het één
elektron en twee protonen opneemt en daarbij een watermolecuul (H2O)
afsplitst. Het is een gecompliceerd proces dat het enzym weet te
versnellen doordat het de 'spelers' in dit gebeuren (het NO2¯ en de
twee protonen) letterlijk in een houdgreep neemt zodat ze er eigenlijk
niet meer aan kunnen ontkomen om met elkaar reageren als er eenmaal
een elektron in de buurt is. Dat elektron wordt weer aangeleverd door
andere eiwitten in de cel die met het NiR tijdelijk een verbintenis
kunnen aangaan.
Rommelig
De manier waarop dat elektron als het eenmaal aangekomen is in het NiR
tenslotte de 'hot spot' bereikt waar de eigenlijke reactie
plaatsvindt, gebeurt nogal rommelig, zo hebben de onderzoekers kunnen
vaststellen. De ene keer komt het elektron snel ter plaatse, de andere
keer langzaam, afhankelijk van de interne dynamica van het enzym. Het
enzymmolecuul is een beweeglijke gelei en de trillingen in deze
pudding hebben effect op de snelheid waarmee het elektron zich in de
pudding kan voortbewegen.
---
The enzyme mechanism of nitrite reductase studied at single-molecule
level
Sofya Kuznetsova, Gerhild Zauner; Gerard W. Canters, Thijs Aartsma,
Leiden University. Hans Engelkamp; Nikos Hatzakis; Alan E. Rowan;
Roeland J.M. Nolte; Peter Christianen, University of Nijmegen
In PNAS (Proceedings of the National Academy of Sciences) Early
Edition 26-02-08.
Volledig artikel (pdf)
Abstract
Het tijdverloop van de fluorescentie-intensiteit van het
nitrietreductase zoals het door de microscoop wordt waargenomen. Het
laat scherpe fluctuaties zien die worden veroorzaakt door het
flikkeren van de fluorescentie, synchroon met de werking van het
enzym. Analyse van die fluctuatie vertelt hoe snel en effectief de
werking van het enzym is.
Universiteit Leiden